实验技术八卦课堂：PCR技术的历史和精髓
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作者：解螺旋·猫大
解螺旋出品，转载须经授权
“呦~好巧啊！你也来八卦实验技术啊！”
之
第二讲 PCR技术（猫大巨献）
那些也许你不知道的PCR诞生史：
早在1971年，Kjell Kleppe等就在名为 “Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases"的研究论文里描述过一个由聚合酶合成双链DNA的过程。作者提出了一些推测，比如，DNA双链可以变性成单链，引物结合到模板上的过程需要克服单链DNA模板形成的二级结构，随后DNA聚合酶完成反应，而当模板双链复性，这个过程可以重新启动。只可惜这些推测缺乏足够的实验证据。
17年后，Kary Mullis和Fred Faloona实验验证了PCR的基本过程。因为Kary Mullis在PCR技术上的突出贡献，1993年，他与Michael Smith共享了诺贝尔化学奖。
但这时候的PCR酶不耐热，一轮反应后酶就不工作了，因此每一轮反应都必须重新添加酶，非常麻烦。就这样，生物狗们一麻烦就麻烦了5年（向任劳任怨的生物狗致敬！）。终于在1988年，Henry Erlich等人从栖热菌中找到了耐热的DNA聚合酶，这一关键的改进使PCR过程进化成只需要加一次酶即可完成反应，而且热稳定性的酶使PCR反应的特异性和灵敏度都大大提升，从而使长时间的反应成为可能。自此，我们所熟悉的PCR技术才算真正诞生。
在PCR技术诞生的过程中还有个有趣的小插曲：在Kary Mullis的文章发表的两年前，Norman Arnheim等人已提出PCR技术在临床诊断上的广阔应用前景，比如鉴定地中海贫血症患者的β-globin基因突变。我们的先辈真是敢做敢想更敢说的典范啊！！！永远都保持超前的节奏！！！比如在PCR技术发明前，远在1972年，先驱型生物狗就已经很HIGH地在玩基因克隆了。。。
PCR技术的本质：
PCR反应是以少量的DNA做模板进行扩增从而得到大量DNA的过程，其本质就是在体外进行的DNA复制。清楚这一点，有助于我们理解进行PCR反应所需的一些必要元素。既然PCR的过程就是DNA复制的过程，那么DNA复制所需要的元素就是PCR反应所需要的。
DNA复制需要哪些元素呢？
1) 需要脱氧核苷三磷酸：
进行DNA合成必须具备的2个关键底物之一，即4种脱氧核苷三磷酸——dGTP、dCTP、dATP、dTTP。
通常商品化PCR酶会提供这4种脱氧核苷三磷酸的混合物dNTP。
2) 需要引物-模板接头：
DNA合成的第二个重要底物是一具有特定序列的双链DNA，称为引物-模板接头，即指导互补脱氧核苷酸添加的单链DNA模板和与模板互补但比模板短的一小段序列。
较长的DNA链有一个与引物退火的区域和一个毗邻的单链DNA区，此区作为DNA合成的模板；较短的引物与较长的DNA链完全退火，且必须有与模板单链DNA区毗邻的游离的3’-OH，当新核苷酸加入时引物的3’-OH端得以延伸。一般而言，引物-模板接头的引物部分才是DNA合成的底物，而模板仅仅提供选择哪种核苷酸进行添加的必要信息。
因此我们在设置PCR反应程序时第一步是高温变性（一般会设置成95℃变性），就是为了把双链的模板变性成单链，第二步是降低温度，是为了让引物能互补匹配到单链模板上。
3) 需要DNA聚合酶：
DNA聚合酶的三维结构类似于一只右手。手掌域是催化活性位点，可以催化任意4种脱氧核苷三磷酸的添加，这一区域结合2个二价金属离子（通常是Mg2+或Zn2+）。其中一个金属离子降低3’-OH对其氢的亲和力，这会产生一个准备对引入dNTP上的α-磷酸进行亲核攻击的3’O-。第二个金属离子与dNTP的β-和γ-磷酸负电荷协同作用，稳定由引物和引入核苷酸连接在一起时所产生的焦磷酸。
所以我们在PCR时，反应体系里加入适量的Mg2+是十分重要的，添加的量少导致PCR酶无法发挥最大活性，添加太多则降低酶反应的特异性。
DNA聚合酶是一种延伸酶，其催化是快速的。DNA合成的速度主要取决于DNA聚合酶的延伸能力。在实际应用中，一般的Taq酶的延伸速度大致是扩增产物在2kb以内是1kb/min。扩增产物超过2kb的部分可以以500bp/min来计算。比如扩增2kb，延伸时间就设置成2min，而扩增3kb，就可以把延伸时间设置成4min。也有延伸能力更强的酶，那么延伸时间就按产品说明书描述的来设置。
OK！我们以Takara Ex Taq这款酶为例来看一下PCR的实地操作：
Look！在这个反应体系里，DNA复制的三大要素都有了，酶、引物-模板、dNTP一个都不少。10×Buffer给酶提供一个合适的离子环境，而且这个buffer里是含有Mg2+的。最后用水把各组分稀释到适当的终浓度。
需要注意的是，这个表格里注明了模板＜500ng。在PCR的时候，常常会出现模板加太多而导致反应抑制出不了条带。控制模板的量也决定着PCR成功与否。
PCR反应条件的设置，猫大给大家一个三步法的万能模板，请看：
Step1: 95℃ 5min
Step2: 95℃ 30s
Step3: X ℃ 40s
Step4: 72℃ ymin
Go to step 2, 30-35 cycles
Step 5： 72℃ 5-10min
Step1是进行预变性，这一步是为了将双链DNA充分变性成单链，一般95℃ 2-5min足够。有的酶说明书会对这一步的条件有具体要求，请注意阅读说明。
Step2-3-4即PCR反应的“变性-退火-延伸”循环。
其中Step2设置为95℃ 30s，30s足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可 缩短该步骤时间，变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
Step3中的温度X是需要根据实验调整的。这个X设置为多少才合适呢？最简单的就是设置成55-60℃。有些特别难进行的PCR反应，还可以把温度降低，我曾经就遇到过把温度降到50℃才能出来条带。还有种选择方式是，如果你的引物是生工合成的，那生工的引物单会给一个引物Tm值，X就设置成Tm直接降5℃就好了，当然Tm减完5℃的值最好要在50℃-60℃之间。
Step4的延伸时间Y也是需要根据实验调整的，调整方法就按上文说的，根据酶的延伸速度来。
然后是循环数的设置。循环数一般控制在30-35 cycles。循环数太少，可能跑电泳就看不到产物条带，循环数太多则PCR反应进入平台期比较不出各组的差别。
最后一步Step5，反应在72℃维持5-10分钟．使引物延伸完全。长的产物相应的时间就设置长一点，短的产物就设置短一点的时间。
怎么样？有没有一种把PCR从头到尾八光光后很爽的感觉？
搞清楚每一个步骤代表的意义，就能很轻松的设置最佳实验条件了！！！PCR不再难！！！
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